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讲稿

体内样品的前处理

--去除蛋白和液液萃取法

在测定体内药物及其代谢物时,除少数情况将体液作简单处理后直接测定外,一般在测定之前要对样品进行适当的预处理,为药物的测定创造良好条件。

样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节,也是分析中最困难,最繁复的工作。由于药物自身的理化特性和存在形式以及生物介质的差异,对于体内样品的预处理很难规定统一方法和固定的程序,而必须结合后续的测定方法对分析样品的要求,采取恰当的预处理步骤。

一、体内样品预处理的目的

1、使待测药物游离  药物进入体内后,即与血浆蛋白结合,同时部分经生物转化生成代谢物及缀合物。通过预处理,使待测药物或代谢物从结合物或缀合物中释放出来,以便测定药物或代谢物的总浓度。

2、满足测定方法的要求  体内样品介质组成复杂、干扰多,而待测药物组分浓度低。因此,需将样品进行适当处理,使组分得到净化和富集,以满足测定方法对分析样品的要求。

3、为了防止分析仪器的污染、劣化,提高测定灵敏度和选择性等。如采用HPLC法测定,为防止蛋白质在色谱柱上的沉积、堵塞,需要除去血浆蛋白质。预处理不仅可以延长色谱柱的寿命,也可以改善方法的选择性(排除生物介质的干扰)和组分的可测性或组分的色谱行为。

二、常用体内样品预处理方法

常用体内样品的预处理方法一般有蛋白沉淀法、液--液萃取法、液--固萃取法。特殊情况下需进行缀合物水解、化学衍生化等。

(一)蛋白沉淀法

在测定血样时,首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物释放出来,以便测定药物的总浓度。去除蛋白法有以下几种方法。

1、溶剂沉淀法  加入与水相混溶的有机溶剂(亲水性有机溶剂),蛋白质分子间的静电引力增加而聚集。常用的水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:(2~3)时,可以将90%以上的蛋白质除去。上清液偏碱性,pH为8.5~9.5。操作时,将水溶性有机溶剂与血浆或血清混合后离心分离,取上清液作为供试溶液。通常用于分离血浆或血清的离心力(约1000´g)不能将蛋白质沉淀完全,而采用高速离心(离心力约15000´g)约5分钟便可将析出的蛋白质沉淀完全。

2、中性盐析法  加入中性盐,溶液的离子强度发生变化,部分蛋白质的电性被中和,蛋白质因分子间电排斥作用减弱而凝聚。常用的中性盐有饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。操作时,按血清与饱和盐溶液的比例为1:(2~3)混合,高速离心约2分钟,即可除去90%以上的蛋白质。所得上清液近中性,pH为7.0~7.7。

3、强酸沉淀法  当溶液pH低于蛋白质的等电点时,蛋白质以阳离子形式存在,可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液。含药物血清与强酸的比例为1∶0.6混合,高速离心约2分钟,就可以除去90%以上的蛋白质。因加入了强酸,上清液呈强酸性(pH 0~4),在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。

4、热凝固法  当待测物热稳定性好时,可采用加热的方法将一些热变性蛋白质沉淀。加热温度视待测组分的热稳定性而定,通常可加热至90℃。蛋白沉淀后可用离心或过滤法除去,这种方法最简单,但只能除去热变性蛋白。

(二)液--液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)

液-液萃取法是传统的分离、浓集方法。多数药物是亲脂性的,在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相的溶解度,而血样或尿样中含有的大多数内源性干扰物质是强极性的水溶性物质,因而可用有机溶剂提取法除去大部分内源性干扰物质。

样品在提取过程中,虽然待测组分得到了净化,但因微量的组分分布在较大体积的提取溶剂中,常需要使待测组分浓集后再进行测定。方法是挥去提取溶剂,残渣复溶于小体积的溶剂。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干;对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物,可采用减压法挥去溶剂。溶剂蒸发所用的试管,底部应为尖锥形,这样可使最后数微升溶剂集中在管尖,便于待测组分的复溶与分取。

应用液--液萃取法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH等。

1、溶剂的选择  溶剂的选择应根据相似相溶的原则进行,选择溶剂时应注意:①对药物分子的未电离形式可溶,而对电离形式不溶;②沸点低、易挥发;③与水不相混溶;④无毒、不易燃烧;⑤具有较高的化学稳定性和惰性;⑥不影响紫外检测。

常用液-液萃取的溶剂

       

2、溶剂的用量  一般有机相与水相(体内样品)体积比为1∶1~5∶1。

3、水相的pH  当pH与pKa相等时,50%的药物以非电离形式存在。对于碱性药物最佳pH为高于pKa 1~2个pH单位;对于酸性待测药物,则要低于pKa 1~2单位。这样,就可使得90%的药物以非电离形式存在,而更易溶于有机溶剂中。

4、提取操作  一般只提取一次。若提取回收率较低(如低于50%)时,可提取2~3次;若干扰物质为脂溶性,不易除去,则可将提取分离出的含药有机相再用一定pH的小体积水溶液反提取后测定,或将反提取液再用有机溶剂提取,如此反复提取可将药物与干扰物质有效分离。

液--液提取法的优点在于它的选择性和低廉的运行成本,以及可对样品进行净化和浓集的特点。所以本法在体内药物分析中,尤其是采用LC-MS测定时被广泛应用。


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