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讲稿



色谱法(chromatography)是一种物理或物理化学分离分析方法,系将混合物中各组分分离后在线或离线分析的方法。色谱法具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点,是分析混合物的最有效手段。色谱法被广泛应用于药品的鉴别、纯度检查和含量测定。本节主要讨论薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法在药物鉴别中的应用。

(一)薄层色谱(TLC)鉴别法

1、原理

薄层色谱法(TLC)系将供试品溶液点样于涂布有固定相的薄层板上,经展开、检视后所得的色谱图,与适宜的对照物按同法操作所得的色谱图进行比较。如图所示,将A、B两组分的混合物溶液点样于薄层板的一端,在密闭的容器中用适当展开剂展开。由于吸附剂对A和B两组分具有不同的吸附能力,展开剂也对A和B具有不同的解吸附能力;因此,当展开剂不断展开时,A、B在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附和解吸附,从而产生差速迁移得到分离。吸附薄层色谱法的固定相为吸附剂,最常用的吸附剂是硅胶,其次有硅藻土、氧化铝、微晶纤维素等。


图1 薄层展开和Rf值示意图

2、操作方法

TLC的操作方法包括点样、展开和检视。

1)点样 除另有规定外,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点,点样基线距底边2.0 cm,样点直径为2~4mm,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜,一般为1.0~2.0 cm。点样时必须注意勿损伤薄层板表面。

2)展开 展开缸如需预先用展开剂饱和。将点好样品的薄层板放入层析缸,浸入展开剂的深度为距薄层底边0.5~1.0 c m(切勿将样品点浸入展开剂中),密封顶盖,待展开至规定距离(一般为10~15 c m)后,取出薄层板,标记好前沿,晾干。

3)检视 荧光薄层板可用荧光淬灭法,即在紫外光(254nm)灯下检视暗斑的位置与强度。普通薄层板 有色物质,可在日光下直接检视。无色物质可用物理或化学方法检视,物理方法是在紫外光(254nm或365nm)灯下或用其他检测仪器检出斑点的荧光颜色及强度;化学方法一般用化学试剂显色后,在日光或紫外光灯下检视。

3、TLC色谱系统适用性试验

TLC法的系统适用性试验包括斑点的检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能。

1)检测灵敏度  指杂质检查时,采用对照溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照溶液在规定的色谱条件下,在同一块薄层板上点样、展开、检视,前者应显示清晰的斑点。

2)比移值 (Rf)  系指从点样基线至展开斑点中心(质量重心)的距离()与从基线至展开剂前沿的距离()的比值。Rf值是薄层色谱法的基本定性参数。可用供试品溶液主斑点与对照溶液主斑点的Rf值进行比较,或用Rf值来说明主斑点或杂质斑点的位置。实践中,Rf值的最佳范围是0.3~0.5,可用范围是0.2~0.8。

3)分离效能  以分离度表示。分离度(R)系指两个相邻斑点中心距离与两斑点的平均宽度(直径)的比值。用于鉴别时,在对照品与结构相似药物的对照品制成的混合对照溶液的色谱图中,应显示两个清晰分离的斑点。

四、应用

1.与对照品比较Rf值  将同浓度的供试品溶液与对照品溶液在同一块薄层板上点样、展开与检视,供试品溶液所显示主斑点的位置(Rf)应与对照溶液的主斑点一致,而且两主斑点的大小与颜色(或荧光)的深浅也应大致相同;或将两溶液等体积混合后,点样、展开与检视,应显示单一、紧密的斑点。

2.与结构相似的物质比较Rf值  选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试品的主斑点比较,两者的Rf应不同,或将上述两种溶液等体积混合应显示两个清晰分离的斑点。

例如,硫酸阿米卡星的TLC鉴别方法:取本品与硫酸阿米卡星标准品适量,分别加水制成每1ml中约含5mg的溶液。照有关物质项下的色谱法试验,吸取上述两种溶液各2ml,分别点于同一硅胶H薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-浓氨溶液-水(1∶4∶2∶1)为展开剂,展开,晾干,喷以0.2%茚三酮的水饱和正丁醇溶液,在100℃加热10分钟。供试品溶液所显主斑点的颜色和位置应与标准品溶液主斑点的颜色和位置相同。

注意事项:由于受到薄层板质量、边缘效应等因素的影响,实际操作中有时会遇到同一物质在同一块薄层板上的Rf值不一的情况,操作中可增加将供试品溶液与对照品溶液等量混合,点样后出现单一斑点作为鉴别依据。

(二) 高效液相色谱和气相色谱鉴别法

1、原理

高效液相色谱法(HPLC),系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入色谱柱,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等特点,是在药品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。

气相色谱法(GC)系采用气体流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。待测组分或其衍生物气化后,被载气带入色谱柱进行分离,各组分先后进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。气相色谱法不适用于难挥发和热稳定性差的物质的分析。

2、在鉴别中的应用

HPLC/GC常用保留值(保留时间)进行鉴别。即在相同的色谱条件下,分别取供试品溶液和对照品溶液进样,记录色谱图,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液的一致。采用内标法时,供试品溶液和对照品溶液色谱图中药物峰的保留时间与内标物峰的保留时间比值应相一致。

采用上述方法进行鉴别时应注意,色谱系统的稳定性要好,同一物质不同时间进样的保留时间重现性必须有保证。这就要求流动相与固定相相匹配,例如疏水性固定相C18链在水相环境中易卷曲,故在常规C18柱的反相色谱系统中,流动相有机溶剂比例通常不应低于5%,否则将造成色谱保留行为不稳定,不利于鉴别。在实际操作中,由于条件不明原因的微小变化,有时存在同一物质在表面完全相同的色谱系统中保留时间不一致的情况,尤其梯度洗脱时此种现象更为常见,此时可增加将供试品溶液与对照品溶液等量混合,进样后出现单一色谱峰作为鉴别依据。


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