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讲稿


焦磷酸测序技术

焦测序技术是一种基于生物发光法测定焦磷酸盐的测序技术,在进行DNA 序列分析时不需要电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,可实现自动化。焦测序平台在分子诊断的各个领域得到了充分的应用,如细菌病毒转基因成分等的序列测定、单核苷酸多态性测定、拷贝数变异测定、基因突变位点测定、microRNA测定、基因表达量测定和药物基因组学研究,具有测序灵敏度高、成本低、操作简便快速等优点,应用前景广阔。

常规DNA序列分析技术是基于双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法),即以DNA单链为模板,在一定条件下,用模板特异性引物在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则,不断将四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)和经不同颜色染料标记的双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)加到引物的3'-羟基末端并使引物链得到延伸或使延伸终止,得到各种连续长度的DNA片段,通过电泳分离,用激光诱导荧光法可以检测到各片段末端碱基的种类。通常该法可以测定500个左右碱基的序列。该法的主要不足在于:只能定性不能定量;适合大规模测序不适合测定单碱基差异;不能测定引物后面的碱基序列。新发展的焦测序 (pyrosequencing)技术[62]是基于单碱基逐个延伸反应的原理,可以克服这些缺点,是Sanger法的重要补充,焦测序技术是一种基于发光法测定焦磷酸盐(PPi)的测序技术[63]。其原理如图所示:引物与模板DNA退火后,在DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、萤光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)四种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP与模板互补时,DNA模板与互补的dNTP聚合时可以产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下,PPi与5’-磷酸化硫酸腺苷反应生成等量的ATP;在萤光素酶催化作用下,ATP与虫萤光素(luciferin)反应发光,最大波长约为560 nm,可用光电倍增管(PMT)或电荷耦合装置(CCD)检测。产生的荧光信号强度与聚合的dNTP个数成正比,根据加入的dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。               

        

                                                                      焦测序技术原理


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课件与视频





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知识点扩展



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作业


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参考资料