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讲稿


生物质谱技术

    20世纪80年代产生的一些新的软电离方式,包括电喷雾电离(Electrospray Ionization)和基质辅助激光解吸电离(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 等,使得质谱能用于分析高极性、难挥发和热不稳定性生物大分子,生物质谱技术也应运而生。目前此技术在基因组学与蛋白质组学方面已得到了广泛的应用。

                

                           MALDI-TOF MS 工作原理

A.离子化区 生物分子和基质形成共结晶,在脉冲激光照射后发生离子化B.电场加速区 离子束在电场中被加速,经过无电场的漂移管后以不同的速度到达检测器,C.检测器 D.信号处理 

目前国内外已有较多文献报道生物质谱在SNP检测方面的应用,与其它检测方法相比,它具有以下优点:(1)准确。因为它检测的是核酸的分子量(准确地讲是荷质比)而不像其它方式检测的是一种衍生出来的变化。(2)快速。获得一个质谱图只需要几秒钟。(3)高通量,耗费少。因为可同时检测多个位点。(4)易于自动化。现在用于单核苷酸多态性研究的质谱技术主要是基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱(ESI-QqTOF MS)。

单核苷酸多态性分析都由两个步骤组成:首先生成等位特异性产物然后对此产物进行分析。目前生成等位特异性产物有4种方法,即通过引物延伸,杂交,酶切或链接反应的方式。这些方法都可应用于MALDI-TOF质谱对SNP的分析。其中利用引物延伸反应是使用最广泛且简单的方法,此方法首先通过PCR将DNA进行扩增,然后立即与一条延伸引物在紧挨多态性位点的上游退火,dNTPs,ddNTPs和聚合酶也被加入反应体系中。延伸反应在多态性位点或多态性位点的下一个碱基终止。引物延伸反应的产物由于延伸的碱基不同,分子量不同,经过MALDI-MS分析后即可区分SNP。

美国Sequenom 公司开发的MassARRAY分子量阵列系统是目前唯一采用质谱法直接检测SNP的设备,能同时处理2块基因芯片,实现高通量多重SNP分析。平均每块芯片上可以进行384个客户样本×15个SNP位点的分型检测,通过机械手的自动化控制和经过事先优化的处理程序,能确保每天实现70000 个SNP基因分型的高通量筛选检测。而此基因分型系统正是结合了引物延伸反应和先进的MALDI-TOF质谱技术。

                                

                              引物延伸反应应用于MALDI-TOF质谱的SNP检测

A.PCR扩增 B. 引物延伸反应 延伸引物设计在紧挨多态性位点的上游 C. MALDI-TOF质谱检测延伸反应的产物

 





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参考资料